实验流程
（
1
）实验流程整体介绍
主要实验步骤
（a）
每
2
天，培养物稀释传代
1
次（稀释率为
1/100
）。
（b）
每
30
次稀释传代，培养物取样冻存（每个进化微宇宙冻存
2
份）。
主要技术标准
（a）
进化实验使用液体培养基
0.1M9KB
（具体为
M9
缓冲液添加
1 g/L
甘油和
2 g/L
和
蛋白胨（
peptone No.3
））。培养系统为
5 mL
（以
50 mL
离心管为容器；
Crystalgen
离心管）。在该实验的几个温度下，该培养基中祖先型大肠杆菌密度约为
(4
e+8)/mL
；祖先型荧光假单胞菌约为
（5e+8）
/mL
。
（b）
测量种群密度使用的平板培养基为
M9KB
琼脂板（含
40 mg/L X-gal
），以及包含卡那霉素（
100 mg/L
）的
M9KB
琼脂板（也含
X-gal
）。竞争实验使用的平板包括
M9KB
琼脂板（含
X-gal
）和
TA
琼脂板。
（
2
）稀释传代
（
a
）培养物在静止培养箱内培养。
（
b
）每次稀释传代应该在上一次
48±4
小时之后进行。
（
c
）每个新的微宇宙含
5 mL
液体培养基。
（
d
）每次稀释传代之前观察各个培养物是否浑浊（清澈的培养物可能是上一次稀释传代错过接种）。
（
e
）振荡培养物，接种
50 μL
至新培养管。
（
f
）对于有迁移处理的微宇宙，在完成稀释传代后使用新培养管进行迁移。按以下迁移方向迁移
50 uL
培养物：
19
到
26°C
，
26
到
31°C
，
31
到
26°C
，
26
到
19°C
。
（
g
）新培养管培养
48
小时。
…
注：每次稀释传代后，旧培养物再放置
2
天后丢弃。如果出现操作失误，某个
N+1
次传代的微宇宙没有成功接种或者因故毁坏，我们使用对应的
N
次传代微宇宙接种
N+2
次传代微宇宙。
（
3
）种群密度测量和样品保存
（
a
）每
200
世代（
30
次稀释传代），测量
1
次种群密度。培养物在
M9
缓冲液中稀释
，涂布
0.1 mL
稀释液至平板。测量大肠杆菌密度：
M9KB
平板（含
X-gal
）
37°C
培养。荧光假单胞菌，含卡那霉素（
70 mg/L
）的
M9KB
平板（也含
X-gal
）
26°C
培养。
（
b
）每
30
次稀释传代，培养物的样品冻存
2
份。培养物与甘油盐比例：
5: 4 (0.75 mL: 0.6 mL)
；于
-80°C
冻存。
（
4
）污染检测
（
a
）菌落表型和计数
在进行菌落计数时，大肠杆菌单作种群培养在
M9KB
平板上（含
X-gal
），在两个温度下培养：
37°C
和
26°C
。在菌落中如果出现不显示蓝色的菌落，意味着可能发生了污染；如果在
26°C
平板上出现的菌落数明显大于
37°C
平板，意味着可能发生了污染。
荧光假单胞菌单作种群培养在
26°C
，在两种不同的平板培养基上：
M9KB
平板上（含
X-gal
）和
M9KB
平板上（含
X-gal
）加卡那霉素（
70 mg/L
）。在菌落中如果出现不显示蓝色的菌落，意味着可能发生了污染；如果在不含有卡那霉素的平板上菌落数明显大于含有卡那霉素的平板，意味着可能发生了污染。
混作群落在三种培养环境下测量种群大小。
M9KB
平板（含
X-gal
）在
37°C
培养，测量大肠杆菌数量；
M9KB
平板（含
X-gal
）加卡那霉素，在
26°C
培养，测量荧光假单胞菌数量；
M9KB
平板（含
X-gal
）在
26°C
培养，测量总的种群大小。如果总的种群大小数量大于单独测量的两个物种种群之和，意味着可能出现了污染。如果出现不显示蓝色的菌落，意味着可能出现污染。
(b)
噬菌体检测
使用侵染大肠杆菌的
T3
噬菌体和侵染荧光假单胞菌的
SBW25ɸ2
噬菌体。在
96
孔板上进行实验。大肠杆菌培养物接种至含有
T3
的培养孔内，荧光假单胞菌培养物接种至含有
SBW25ɸ2
的培养孔内，混作群落培养物接种至含有两种噬菌体的培养孔内。每个培养孔含有
200 μL
培养基以及噬菌体（每种噬菌体密度为
(1e+6)/
L
）。接种
2 μL
培养物至培养孔，在
26°C
培养
8-10
小时。培养孔如果变浑浊，意味着可能发生了污染。
注：需要在
10
小时之内观察。在没有噬菌体的情形下，
10
小时的培养可以使得培养孔变浑浊。在有噬菌体的情形下，荧光假单胞菌（没有污染）可以在
12
小时内进化出明显的对噬菌体的抗性，而发生明显的种群生长（变浑浊）。因此这个方法对于检测荧光假单胞菌培养物的污染问题并不很好用。
（
5
）从混作群落中分离单物种种群
从混作群落中分离出大肠杆菌种群：将5 μL培养物接种至5 mL培养基，在40°C培养2天，然后接种5 μL至5mL新鲜培养基在其进化温度下培养2天。用以下方法检测是否成功去除了荧光假单胞菌：高温培养后的培养物接种2 μL至200 uL培养基（含卡那霉素；96-孔板上），在10°C培养2天（3个重复），如果这些培养物变浑浊，意味着可能没有完全去除荧光假单胞菌。
从混作群落中分离出荧光假单胞菌种群：将5 μL培养物接种至5 mL含有卡那霉素的培养基，在10°C培养2天，然后接种5 μL至5mL新鲜培养基在其进化温度下培养2天。用以下方法检测是否成功去除了大肠杆菌：抗生素处理生长2天后的培养物接种2 μL至200 uL培养基（96-孔板上），在40°C培养2天（3个重复），如果这些培养物变浑浊，意味着可能没有完全去除大肠杆菌。
（
6
）适合度测定和性状测定
（
a
）相对于祖先型的适合度
使用
E. coli
REL607
（
Ara+
）作为参考菌株测量进化后大肠杆菌（
REL606
；
Ara-
）的适合度。前者在
TA
平板上显白色，后者显红色。每个培养物在检测环境中驯化一次传代后进行竞争实验（驯化培养阶段初始时接种
50 μL
活化培养物进入
5 mL
驯化用培养基）。两个竞争者的驯化后培养物各接种
25 μL
进入
5 mL
竞争实验用培养基，培养
2
天。在竞争环节的起始和结束时间点测量种群大小。
使用
P. fluorescens
（
SBW25
）作为参考菌株测量进化后荧光假单胞菌（
SBW25EeZY6KX
）的适合度。前者在含有
X-gal
的平板上显白色，后者显蓝色。
（
b
）物种之间竞争能力
两个竞争种群在检测环境中驯化一次传代，之后在单种和混作情形下培养
4
次稀释传代，其中混作培养的初始接种比例为
1
：
1
体积比例，测量种群密度。
（
c
）种群增长曲线
检测环境中驯化一次传代后，接种
2 μL
至
200 μL
培养基（在
96
孔板上），然后在酶标仪内培养
2
天，并使用酶标仪测量光吸收值。培养过程中无振荡。
附录：培养基配方
M9 buffer:
Make 10×M9 buffer, and autoclave. Use this stock to make standard M9 buffer.
Formula for standard M9KB
|
|
g/ liter
|
g/ 0.5liter
|
g/ 0.25liter
|
|
Proteose peptone No. 3
|
20
|
10
|
5
|
|
Glycerol, C.P.
|
10 mL
|
5 mL
|
2.5 mL
|
|
Na2HPO4 (Na2HPO4
·
12H2O)
|
6 (15.12)
|
3 (7.56)
|
1.5
|
|
KH2PO4
|
3
|
1.5
|
0.75
|
|
NH4Cl
|
1
|
0.5
|
0.25
|
|
NaCl
|
0.5
|
0.25
|
0.125
|
|
Agar
|
15
|
7.5
|
3.75
|
注：MPCEE实验使用的'0.1M9KB'为M9缓冲液 +
1 g L-1
glycerol 以及 2 g L-1 peptone (No.3).
M9KB Agar:
M9KB with 15 g/L agar.
Kanamycin:
make 50 mg/mL stock, filter-sterilized and frozen stored. Working concentration: 100 mg/L .
X-gal:
make 20 mg/mL stock (dissolved in dimethylformamide, stored at 4 °C, protected from light), working concentration: 40 mg/L.
TA agar plates:
TA (tetrazolium and arabinose) to distinguish E. coli 606 and an Ara+ revertant mutant in competition assays. REL 606 shows red color and the Ara mutant appears white when grown as colonies. TA plates are incubated at 26°C for 48 h.
Formula of TA:
|
|
g/ liter
|
g/ 0.5liter
|
g/ 0.25liter
|
|
Tryptone
|
10
|
|
|
|
Yeast extract
|
1
|
|
|
|
NaCl
|
5
|
|
|
|
Agar
|
16
|
|
|
|
Antifoam (5%)
|
1 mL
|
|
|
|
L(+)Arabinose
|
10
|
|
|
|
TTC (5%)
|
1 mL
|
|
|
TTC is the tetrazolium indicator dye. Use Sigma T8877.
Split the water, and autoclave the arabinose separately from the rest of the medium. Combine the two parts after autoclaving, and then add the TTC from a sterile stock solution and mix. Or sterilize arabinose using filter.
Glycerol saline
|
|
g/ liter
|
g/ 0.5liter
|
g/ 0.25liter
|
g/ 0.01liter
|
|
NaCl
|
8.5
|
|
|
0.85
|
|
Glycerol
|
700
|
|
|
70
|
|
Water
|
300
|
|
|
30
|
(cultures and clycerol saline, 10: 8)